中藥的成分非常復雜,以往常用的薄層色譜等方法因其精密度、準確度、靈敏度、重現(xiàn)性差而不能滿足現(xiàn)代中藥的需要。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點成為中藥研究的最重要的分析方法。目前高效液相色譜已經(jīng)廣泛應用于生物堿、皂苷、黃酮、蒽醌、香豆素等各種中藥有效成分的測定。近年來對高效液相色譜監(jiān)測中藥的研究非常多,由于高效液相色譜集經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的優(yōu)勢于一身,無論柱效、選擇性還是分析程度都達到或超過了它們,近年來對高效液相色譜的不足之處進行了改進,使這項技術日臻完善。
1、高效液相色譜發(fā)展近況
高效液相色譜在藥物分析中的應用,主要考慮試樣的預處理和分析柱、檢測器的選擇。在試樣的預處理上,日前興起的固相(微)萃取使得許多含量低的成分得到精制提純,從而適于高效液相色譜的測定,而孫新國采用逆流萃取測定川芎嗪含量取得了很好的效果。中藥中有些紫外吸收弱,或無特征紫外吸收的成分,直接用高效液相色譜測定,其靈敏度和分離度都不盡人意,利用柱前或柱后衍生化法可使這些成分較精確地測定出來。對于極性大、脂溶性差物質(zhì),在YWGCl8柱上不易保留,用十二烷基磺酸鈉作為離子對試劑,降低其極性,延長柱上的保留時間,取得較好的分離較果。將液相色譜和質(zhì)譜這兩個強有力的分析技術在線連接在一起,經(jīng)過三十年的發(fā)展已成為一項較為成熟的分析手段,但是它從形成伊始就存在著問題:從液相色譜流進質(zhì)譜時,流動相的變化、溶劑的組成、高溫高壓離子化的問題制約著這種聯(lián)用技術發(fā)展,大氣壓離子化接口具有去除溶劑和離子化的雙重功效,它的引入,使得該技術在各個領域得到了廣泛的應用。電噴霧離子源是一種軟電離技術,一般只生成(M H) 和(M-H)-兩種分子離子峰,選擇性監(jiān)測(mz)190的負分子離子峰,具有較高的靈敏度、準確度、專一性,滿足了低濃度藥物研究的需求。由張莉等人研究的三維高效液相色譜法可以同步測定葛根素和阿魏酸兩種指標。通過實驗證明:如果選擇合適的柱溫等色譜條件,乙醇作為反相高效液相色譜流動相,分析中藥及中成藥中有效成分,既安全又準確。結構相似的物質(zhì),普通的檢測器難以檢測出來,高效液相色譜-電化學法可以有效地測定黃連粉中僅差一個基團的黃芩苷和黃芩素的含量。樣品經(jīng)色譜柱分離后收集,再經(jīng)熒光分光光度計測熒光強度,影響因素多,測定復雜,改進后的高效液相色譜-熒光法則可以不經(jīng)衍生化和收集分離物,只經(jīng)化學處理除雜,濃縮后直接進樣即可。用該法測定貫葉連翹中金絲桃素的含量也取得了較好的結果。高效液相色譜-示差折光測黃芪精口服液中黃芪甲苷的含量也都取得了較為滿意的結果。對于只有紫外末端吸收,用紫外檢測時靈敏度低,基線易漂移,示差折光檢測其易受外界條件干擾,蒸發(fā)散射檢測器能克服以上不足,響應值只與樣品質(zhì)量有關,其信號相應與質(zhì)量成正比,不同化合物,質(zhì)量相同則信號相應基本一致。蒸發(fā)光散射檢測法是基于不揮發(fā)樣品分子對光的散射程度與其質(zhì)量成正比,與其所含基團性質(zhì)無關。只要選擇適當?shù)臋z測器參數(shù),便可使流動相和溶劑完全氣化,不產(chǎn)生信號,而樣品中的各個組分以不揮發(fā)粒子存在,對光有散射,以被檢測出來。因此,蒸發(fā)光散射檢測器可用于含不同基團的多組分同時分離、分析。和紫外、熒光等方法相比,蒸發(fā)光散射檢測法對不同物質(zhì)有近似相同的響應因子,
因而不出現(xiàn)低濃度、高響應或高濃度、低響應的現(xiàn)象,有利于不同比例混合物的準確測定.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢驗法測定銀杏葉中萜類內(nèi)酯含量、紅參及育精膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量和藤黃中藤黃酸含量都得到了很好的結果。
2、高效液相色譜的研究動向
2.1 縮短分析時間,提高分離效率。應用先進的檢測儀器和方法,對流動相、固定相進行調(diào)節(jié)或改變,采用梯度洗脫、柱切換技術有望解決這個問題。梯度洗脫的高效液相色譜法,能分析較寬極性范圍的樣品,較等度洗脫具有很大的優(yōu)勢,但對于成分更復雜、極性范圍更寬的中藥樣品則有些力不從心。多柱高效液相色譜法又稱多維高效液相色譜法。除具有梯度洗脫一樣的改變流動相濃度的優(yōu)點外,還可以改變固定相種類、鍵合度、粒徑、柱長、柱徑等及流動相種類、濃度等。
